GLP-1(קישור:https://www.bloomtechz.com/synthetic-chemical/peptide/glp-1-peptide-cas-87805-34-3.html) הוא הורמון פוליפפטיד המורכב מ-30 חומצות אמינו. עם המחקר המעמיק על GLP-1, פותחו עוד ועוד שיטות סינתטיות. מאמר זה יציג באופן שיטתי את שיטות הסינתזה המוכרות כיום של GLP-1.
שיטה 1, סינתזה של שלב מוצק:
סינתזת פאזה מוצקה היא שיטה בשימוש נרחב לסינתזת פפטידים וחלבונים, והיא משמשת בדרך כלל גם לסינתזה של GLP-1. בסינתזה של שלב מוצק, מבנה הליבה נוצר על ידי קישור חומצת האמינו הראשונה לשרף. לאחר מכן, חומצת האמינו הבאה מתווספת ברצף ומגיבת כימית עם חומר עיבוי מתאים. לבסוף, ניתן להשיג את תוצר המטרה על ידי ביקוע הפוליפפטיד מהשרף.
החשיבות של סינתזה בשלב מוצק היא בכך שהיא מאפשרת אוטומציה וייצור בקנה מידה גדול של סינתזת פפטידים. שיטות סינתזה מוצק של שלב מוצק כיום כוללות Fmoc ו-Boc. ביניהם, שיטת Fmoc משתמשת בקבוצת ההגנה N-Fmoc להגנה על הפפטיד, בעוד ששיטת Boc משתמשת ב-tert-butyloxycarbonyl להגנה על קבוצת הקרבוקסיל.
שיטה שניה, סינתזה של שלב נוזלי:
סינתזת שלב נוזלי היא שיטה מסורתית של סינתזת פפטידים בה מכניסים את המגיבים לשלב הנוזלי לצורך התגובה. היתרון של סינתזה של שלב נוזלי הוא שתנאי התגובה מתונים ומתאימים לשינוי של מבנים כימיים רגישים. עם זאת, בשל יותר מדי מגיבים, תהליך הטיהור מסורבל יחסית. תגובות כימיות בסינתזה של שלב נוזלי כוללות:
1. תגובת עיבוי:
תגובת עיבוי היא אחת התגובות הבסיסיות ביותר בסינתזת פפטידים, כלומר, קבוצת הקרבוקסיל המופעלת על ידי חומרי עיבוי כגון DCC ו-HOBt מחוברת לקבוצת האמינו של חומצת אמינו באמצעות תגובת אצילציה. תנאי התגובה קלים והתשואה גבוהה.
2. תגובות אלימינציה:
תגובת האלימינציה היא הפחתת המתיונין לדיתיול על ידי NaBH4 וחומרים מפחיתים אחרים, מה שהופך אותו ללא פעיל. התגובה צריכה להתבצע בתנאים בסיסיים.
3. הסרת קבוצות הגנה:
בשל התפקודים השונים של חומצות אמינו בשרשרת הפפטידים, ישמשו קבוצות הגנה שונות להגנה. לאחר השלמת הסינתזה, יש להסיר את קבוצת ההגנה. עבור שיטת Fmoc, piperidine משמש בדרך כלל להסרת Fmoc; בעוד עבור שיטת Boc, TFA משמש להסרת Boc.
שיטה שלישית, סינתזה כימית:
GLP-1 הוא הורמון פוליפפטיד בעל פעילויות ביולוגיות חשובות. ניתן לממש את הסינתזה שלו בשיטות שונות, ביניהן סינתזה כימית היא אחת השיטות הנפוצות ביותר. היתרון של סינתזה כימית הוא בכך שהיא יכולה לייצר מוצרי מטרה טהורים ביותר, המתאימים לייצור בקנה מידה גדול. שיטת הסינתזה הכימית והשלבים המפורטים של GLP-1 יוצגו להלן.
1. מסלול סינתטי ובחירת קבוצת הגנה:
מולקולת GLP-1 מורכבת מ-36 חומצות אמינו, כולל 21 חומצות אמינו מסוג L ו-15 חומצות אמינו מסוג D. לפני ביצוע הסינתזה, יש צורך לבחור מסלול סינתטי מתאים ולבחור את קבוצת ההגנה המתאימה בהתאם לתנאים הסינתטיים. סינתזה מוצקה של Fmoc משמשת בדרך כלל לסינתזה אוטומטית בקנה מידה גדול. שיטה זו משתמשת בהגנה על N-9-fluoroimido carboxyl (N-Fmoc) כקבוצת הגנה, וצריכה גם לבחור קבוצת הגנה משנית מתאימה (כגון tert-butyl או מתיל) כדי להבטיח הגנה על אתרים ספציפיים. בכל פעם שמתווספת חומצת אמינו חדשה, יש להסיר תחילה את קבוצת ההגנה Fmoc, ולאחר מכן להוסיף את חומר הצימוד המוגן של חומצת האמינו הבאה.
2. סינתזה של רצף חומצות האמינו הליבה:
רצף הליבה של GLP-1 מורכב מ-21 חומצות אמינו, כולל סרין מפתח וארבעה רצפי דיפפטיד של חומצה פרוליל-גלוטמית. בסינתזה של שלב מוצק, ניתן לחלק את הסינתזה של רצף הליבה לשלבים הבאים:
2.1. הוסף קרבמט חומצה אצטית (Fmoc-NH-CH2CO2Et) ו-2-Cl-Trt-Cl לשרף סינטטי שלב מוצק, ובצע תגובת עיבוי עם חומר צימוד DIC/NMM.
2.2. הסר את קבוצת ההגנה של Fmoc על ידי ביטול תגובת הקבוצה.
2.3. הוסף את חומצת האמינו הבאה, חזור על שלב 1 ושלב 2 ברצף עד לסונתז של רצף הליבה.
2.4. היווצרות מבני פנטפפטיד על שרף שלב מוצק. הוסף את מגיב האצטליזציה לשרף המוצק, הגיב עם חומר הזיהוי ה-N-טרמינלי (כגון HBTU), הוסף את קבוצת ההגנה על שרשרת הצד של סרין כחומר מפחית עזר, ולאחר מכן הסר את קבוצת ההגנה Fmoc.
2.5. תחת הקטליזה של Bacillus subtilis transferase (ProTide), מבנה הפנטפפטיד עובר תגובת החלפה עם המבשר של סרין יודואצטט.
3. סינתזה של רצף חומצות האמינו הנותר:
לאחר השלמת הסינתזה של רצף הליבה, יש צורך להמשיך ולהוסיף את חומצות האמינו הנותרות, כולל חומצות אמינו מסוג L ו-D. התוספת של חומצות אמינו אלו צריכה להתחיל מרצף הליבה, להוסיף את חומצת האמינו הבאה ברצף ולהשתמש בחומר העיבוי המתאים כדי לבצע תגובות כימיות עד לסונתז של מולקולת פוליפפטיד GLP-1 מלאה. במהלך תהליך זה, יש צורך גם לבחור קבוצת הגנה מתאימה לפי הצורך, ולבצע את שלבי התגובה, הסרת קבוצת ההגנה והוספת חומצת אמינו ברצף.
4. טיפול בנתרן הידרוקסיד:
לאחר הוספת כל חומצות האמינו, נוצרת שרשרת פפטידים מסונתזת לא מלאה על השרף המוצק וצריך לעבד אותה ליצירת מולקולת פפטיד שנוצרה במלואה. ראשית, יש לבצע הידרוליזה של הפפטיד שלא נוצר על ידי נתרן הידרוקסיד, כך שקבוצת ה-C-terminal carboxyl המחוברת במקור לשרף מנותקת מהשרף, וקבוצת המגן מנותקת במים. לאחר תגובת הידרוליזה, תוצר המטרה מתקבל.
5. משקעים ושטיפה:
לאחר הטיפול, התמיסה שעברה הידרוליזה מטופלת בחומצה כדי לזרז את מוצר המטרה. לאחר מכן, הגלולה הושעתה מחדש במים, ולאחר מכן כביסה אינטנסיבית להסרת זיהומים.
6. טיהור:
השלב האחרון הוא טיהור של המוצר הרצוי, בדרך כלל באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים. במהלך תהליך זה, ניתן לקבוע את טוהר המוצר על ידי זיהוי שיא התמיסה בספקטרום המסה. בקיצור, הסינתזה הכימית של GLP-1 דורשת סבבים מרובים של תגובות מורכבות ותהליכי טיהור קפדניים כדי להשיג סוף סוף את מוצר היעד הפעיל.
שיטה רביעית, ביוסינתזה:
GLP-1 הוא הורמון פוליפפטיד חשוב בעל השפעות פיזיולוגיות שונות, כולל קידום הפרשת אינסולין, דיכוי תיאבון, הפחתת משקל הגוף ושמירה על רגישות לאינסולין וכו'. שיטת הביוסינתזה של GLP-1 מסונתזת בעיקר על ידי תאי L בבלוטת הלבלב, וקצב הסינתזה שלה מווסת עם צריכה תזונתית. הצעדים המפורטים מוצגים כדלקמן:
1. עבודת הכנה לפני סינתזה:
לפני הביוסינתזה של GLP-1, יש צורך לבצע עבודת הכנה מסוימת, כולל קביעת סוג התא בשימוש, קביעת תנאי התרבית ובחירת האנזים הקטליטי המתאים. תאי L הם המקור העיקרי לסינתזה של GLP-1 מכיוון שהם מכילים מבשרים של שני הורמונים, GIP (פפטיד דמוי גלוקגון 1) ו-GLP-1. ניתן לבודד תאי L מאפיתל המעי של ארנבות או עכברים. לפני הביוסינתזה, יש לגדל תאים למספר מספיק, ולספק מספיק חומרים מזינים ותנאי תרבית מתאימים. בנוסף, יש צורך לבחור את האנזים הקטליטי המתאים לקידום התגובה.
2. סינתזה ועיבוד של מבשרים:
הביוסינתזה של GLP-1 מתרחשת בעיקר בתאי L, והמבשר שלה מורכב משני הורמונים, GIP ו-GLP-1. לאחר כניסה לתאים אנדוקריניים, GIP ו-GLP-1 מעובדים על ידי אנזימים פרוטאוליטיים ומתפצלים לפפטידים בודדים. סדרה של אנזימים וקו-פקטורים מעורבים בתהליך זה, כולל פוליפפטיד אסידאז מבשר (PC2), איזומראז וגורמי הידבקות מאוחרים.
3. המרה הדדית בין מקטעי פוליפפטיד:
לאחר העיבוד, הפפטידים GIP ו-GLP-1 משולבים מחדש ליצירת הפוליפפטיד GLP-1. תהליך זה מצריך שימוש בפפטיד דמוי גלוקגון 1 (GLP-1) כתבנית שאליה משולבים פפטידים בודדים אחרים ליצירת פוליפפטידים מרוכבים חדשים. תהליך זה דורש גם כמה אנזימים וגורמים ספציפיים, כולל Prohormone Convertase 1/3 (PC1/3) ו-Carboxypeptidase E (CPE).
4. הפרשת GLP-1:
לאחר סינתזה ועיבוד של GLP-1, הוא מאוחסן בציטופלזמה ובשלפוחיות הפנימיות של תאים אנדוקריניים. כאשר מעוררים על ידי תזונה, תאים אנדוקריניים משחררים GLP-1 ונכנסים למחזור הדם דרך כלי דם. תהליך זה מווסת ומבוקר באמצעות סדרה של מסלולי העברת אותות, כולל cAMP-Ca2 פלוסוכולי.
בקיצור, הביוסינתזה של GLP-1 כוללת פעולה משותפת של מספר קישורים וגורמים. השילוב של ביוסינתזה וסינתזה כימית יכול לספק בסיס ותמיכה טובים יותר למחקר וייצור של GLP-1.
שיטה חמישית, סינתזה אנזימטית:
סינתזה אנזימטית היא סינתזה של שרשראות פפטידים באמצעות קטליזה של אנזימים ביולוגיים. בהשוואה לשיטות סינתזה מסורתיות של שלב נוזלי, ניתן לבצע סינתזה אנזימטית בטמפרטורת החדר, וניתן לבחור מגוון רחב של חומרי גלם. בדרך כלל משתמשים באנזימים כמו תטא-נוזל סינתאז, AEP, ACE וכו' כדי לזרז את הסינתזה.
לסיכום, השיטות שהוזכרו לעיל הן שיטות מעשיות לסינתזה של GLP-1. שיטות שונות מתאימות לתנאי ניסוי ולסביבות ייצור פרמצבטיות שונות.